大家好！推荐一篇NCB的文章，SmallmoleculesthattargetgroupIIintronsarepotentantifungalagents.作者是霍华德?休斯医学研究所和耶鲁大学生物学系的AnnaMariePyle教授，其个人兴趣为：（1）长链非编码RNA的三级结构和折叠途径，比如今天介绍的II型内含子的自剪接；（2）RNA解旋酶的分子机制；（3）通过计算手段研究RNA的结构。
RNA的结构影响着许多代谢过程。在真核生物中，自剪接组II型内含子是一种线粒体RNA的三级结构，其不存在于脊椎动物中，但对植物、真菌的呼吸过程至关重要。本文利用体外高通量筛选、SAR和先导化合物优化得到了自剪接组II型内含子的抑制剂，并证明了该抑制剂对人体无毒副作用。因这类小分子是Candidaparapsilosis（近平滑念珠菌）的有效抑制剂，因此本文的研究为相关疾病的治疗提供了可能。
在生物体中，RNA参与了许多代谢过程，因此研究人员考虑采用RNA分子作为药物靶点。目前除了细菌核糖体开关的抑制剂外，人们尚未利用高通量筛选和经典药物化学方法获得RNA三级结构的小分子抑制剂。正交靶向特定RNA结构的小分子可通过多种的方式调节基因表达，从而治疗相关疾病。
以往研究表明，折叠的RNA分子会与小分子以较高的亲和力相结合。不同于以往的针对小的RNA二级结构元件的研究，本文将RNA的三级结构作为靶点，并使用致病性酵母菌Candidaparapsilosis作为研究对象。
该组首先使用高通量荧光检测法监测S.cerevisiae细胞中ai5γII型内含子的核酶活性。该组将荧光基团和荧光淬灭剂连接在断裂点的两侧，因此当底物被核酶裂解时会出现荧光现象。随后该组在含有1万个分子的库中筛选得到了16个具有相似结构的化合物，其中最优的化合物1的结构如下图所示。随后该组利用这一结构来确定SAR和设计优化的小分子抑制剂。
在进行体外SAR研究时，该组对含有完整ai5γ内含子和短内含子的mRNA前体进行了强效的二次放射分析自剪接实验，以此得到了相应化合物的Ki值。与此同时，该组设计了一系列化合物来分析该抑制剂的药效团。发现：A区的羟基移除或被替换为甲氧基和硼酸基极大地影响活性、C区的每个羟基都可被去除或替换为卤原子、B区的α,β-不饱和酮具有极高的反应活性，将其替换为相应的酮，发现其活性有所增高(2倍)。该抑制剂的活性对B区的结构和C区的远端修饰也很敏感，不只受A区的影响。最终得到了新的先导化合物9。随后通过对化合物9的进一步优化，该组发现在C区添加大的取代基或带正电的残基可以提高相应化合物的抑制活性(降低Ki)。此外利用脉冲追踪稀释实验，该组还发现了抑制剂与内含子结合的可逆性。
在随后进行的体内实验中，因为ai5γII型内含子中断了编码S.cerevisiae细胞色素氧化酶(COX1)第一亚基的基因，因此当ai5γII型内含子被破坏时会形成具有相应缺陷的小菌落。这些菌落不能在甘油等不可发酵的碳源上生长，但他们可以在葡萄糖上生长。为了检验所得抑制物是否会引起呼吸缺陷，该组比较了在抑制剂作用下，S.cerevisiae在YPD和YPGE培养基中生长的情况。最终发现，S.cerevisiae在YPGE培养基上的生长受到抑制，在YPD培养基上可正常生长。为进一步验证所观察到的生长缺陷是由剪接过程引起的，该组测试了抑制剂对含有完整COX1第一亚基基因的S.cerevisiae的作用，最终证明该抑制剂在体内具有抑制作用。
接下来为验证抑制剂的选择性以及该抑制剂是否仅对RNA的三级结构起作用，该组监测了化合物19在各种过量的RNA(separateai5γintrondomainsD1,D3,D56,theU2-U6snRNAstem-loopandyeasttRNAPhe)存在下的抑制活性。此外，该组还测试了抑制剂对另外两个已知剪接体系的作用(I型和Spliceosome)，最终发现剪接体的加工，I型内含子的剪接以及来自不同于IIB亚类的II型内含子的剪接不受小分子抑制剂的影响。
本文还利用类似方法测试了该小分子抑制剂对COX1基因中含有与ai5γ内含子类似的IIB型内含子的C.parapsilosis的作用，并发现ai5γ内含子抑制剂可显著抑制C.parapsilosis的生长。最后，本文还发现化合物18和19对人体细胞并不具有毒性。
以往的抗菌化合物被认为是针对核糖体RNA的，且以往的研究仅针对于小的RNA二级结构元件，而非RNA的三级结构，因此本文为抗菌药物的设计提供了新的思路；此外，真菌与其余真核细胞具有相似的酶和代谢途径，因此治疗真菌类感染疾病是十分困难的。然而因两者的RNA代谢方式有很大不同，因此本文将RNA的三级结构作为靶点来实现相关疾病的治疗。
作者：QYF
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