本文原载于《中华结核和呼吸杂志》年第1期
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指导解读G试验结果。
近年侵袭性真菌病(invasivefungalinfection,IFI)的发病率居高不下,早期诊断和治疗能显著提高生存率。传统的真菌病诊断方法包括痰、血或BALF的真菌培养,组织病理及特征性的影像表现。但这些诊断方法的特异性和敏感性均较低,且周期长,存在诊断延迟的可能;创伤性诊断手段受患者病情和身体状况的限制,因此,非创伤性的快速检测方法受到重视。
1,3-β-D葡聚糖(1,3-β-D-glucan,BG)广泛存在于真菌细胞壁,占真菌壁成分的50%以上,吞噬细胞吞噬处理真菌后,BG被释放到血液和体液中,因此,对外周血或体液中BG的检测适用于除隐球菌和接合菌(毛霉)外几乎所有深部真菌感染的早期诊断。BG的检测利用BG能特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子,引起裂解物凝固的特性,故对BG的检测称为G试验。目前,国内外使用的G试验试剂盒种类繁多,存在原料、检测方法及阈值的差异,加之导致G试验假阳性的因素众多且难以避免,严重影响G试验在诊断真菌感染中的应用。现将G试验诊断真菌感染的现状和研究进展综述如下。
1.G试验试剂盒:日本及欧美经食品药品监督管理局批准上市的G试验试剂盒共有4种,分别是Fungitell(MA)、Fungitec-G、Wako和Maruha,后3种为日本生产[1]。Fungitec-G和Maruha试剂盒使用中国鲎试剂,Wako和Fungitell试剂盒使用美洲鲎试剂。Wako试剂盒采用动态比浊法测定,其余试剂盒均采用比色法测定,其中Fungitec-G和Fungitell试剂盒采用动态比色法,Maruha试剂盒采用终点比色法。Fungitell试剂盒仅用于检测血清标本,其余试剂盒对血清及血浆标本均可检测。由于采用的鲎试剂不同,检测方法也略有差别,这4种试剂盒的检测结果及阳性阈值(cut-off值)各不相同,甚至同一种试剂盒的阳性阈值在不同文献报道中也存在较大差异。Wako和Maruha试剂盒的阈值为2～11ng/L,最常用阈值为11ng/L;Fungitell试剂盒的阈值为31～ng/L,最常用阈值为60～80ng/L;Fungitec-G试剂盒的阈值为20～80ng/L,最常用阈值为20ng/L。国产G试验试剂盒种类繁多,鲎试剂、检测方法及阈值的差异巨大,且由于缺乏统一的生产和质量控制标准,检测结果的差异更大。
欧洲癌症治疗研究组织(EORTC)和美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组将G试验阳性列为拟诊IFI的判断标准之一[2]。但目前缺乏比较上述各种G试验试剂盒的研究,故无法判定各种G试验试剂盒的优劣。
2.G试验的影响因素:导致G试验假阳性的因素众多,且难以避免,使得G实验的临床实际应用价值受损[3]。导致G试验假阳性的因素包括革兰阳性菌感染[4]、绿脓杆菌感染[5]、菌血症[4,6]、血液透析[7]、空气中的尘埃[8]、输注白蛋白[9-10]及免疫球蛋白[10-11]、抗凝药物[7]、血液标本接触纤维材料[12]及使用非无热原试管[3]。众多抗生素,包括多黏菌素、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢吡肟、磺胺异唑、厄他培南及阿莫西林/舒巴坦,均会导致G试验假阳性[13]。
G试验的检测过程对标本、耗材、操作条件和环境的要求也极其严格,这些因素均会对G试验结果产生影响。血清标本在血液自然凝固过程中排除了纤维蛋白丝和残留细胞的干扰,故G试验采用血清标本检测优于血浆标本。溶血标本、脂血症标本、乳糜血症标本及严重黄疸患者的血标本均不适合G试验检测。需使用无热原真空试管采血,3h内送检,标本需冷藏在4～8℃,长期保存需-70℃冻存,反复冻融标本会严重影响检测结果。操作过程中需使用专用试管和吸头,不能有细菌和真菌污染,需在洁净环境中或生物安全柜内全程无菌操作。此外,G试验是定量检测,由于各个实验室的环境或检测仪器的厂家不同,故G试验不能使用厂家说明书中提供的均值和标准差,必须在各自检测条件和环境下重新标定,并在检测前重新制作标准曲线,以消除环境因素对试验结果的影响。更换不同批次试剂时,也需要重新制作标准曲线,以消除不同批次试剂造成的误差。
3.G试验的诊断价值:G试验的临床研究多为回顾性病例对照研究,多数研究报道的G试验敏感度为38%～90%,特异度为45%～%,阳性预测值为30%～89%,阴性预测值为73%～97%[10,14-17]。荟萃分析结果显示,血液病和干细胞移植患者的G试验特异性和阳性预测值更好,但各个研究的异质性极大,故G试验对IFI的诊断价值总体评价为中等[16,18-19]。造成异质性的原因除前述G试验的各种影响因素外,还与各研究对照组的设置差异及检测试剂盒的不同有关。
年发表的一项多中心、针对血液系统和其他实体脏器恶性肿瘤及粒细胞缺乏患者IFI的回顾性研究(Fungitell试剂盒)发现,cut-off值为60ng/L时,G试验的诊断敏感度为69.9%,特异度为87.1%,阳性预测值为83.8%,阴性预测值为75.1%;cut-off值为80ng/L时,G试验的诊断敏感度为64.4%,特异度为92.4%,阳性预测值为89%,阴性预测值为73%;念珠菌病(例)的cut-off值为60ng/L时,G试验的阳性率为81.3%;cut-off值为80ng/L时,阳性率为77.6%;曲霉病(10例)的阳性率均为80%[20]。年发表的另一项回顾性研究(Fungitell试剂盒)发现,cut-off值为80ng/L时,G试验对包括侵袭性肺曲霉病(invasivepulmonaryaspergillosis,IPA)、侵袭性念珠菌病(invasivecandidiasis,IC)和肺孢子菌肺炎(pneumocystisjirovecipneumonia,PJP)等真菌感染诊断的敏感度为77.8%,特异度为92.5%[21]。年发表的回顾性研究(Fungitell试剂盒)在避免了前述研究对照组设置的缺陷后发现,cutoff值为80ng/L时,G试验的诊断敏感度为64%,特异度为84%[10]。一项针对急性白血病粒细胞缺乏患者IFI的研究(Wako试剂盒)发现,cut-off值为7ng/L时,G试验的诊断敏感度为63%,特异度为96%,阳性预测值为79%,阴性预测值为91%;IFI患者G试验阳性出现的时间比影像学异常出现的时间早,IA患者早2.5d,IC患者早10.5d;也早于按照EORTC/MSG颁布的真菌诊断标准确诊的时间,IA患者早3d,IC患者早16d[22]。
G试验对IA的诊断效力等于或低于半乳甘露聚糖检测(GM试验)。一项针对血液系统恶性肿瘤患者IA的前瞻性研究(Wako试剂盒)结果显示,GM及G试验的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值分别为1.00、0.93、0.55、1.00(cut-off值为0.6ng/L)和0.55、0.93、0.40、0.96(cut-off值为0.55ng/L),G试验的诊断敏感度低于GM试验[23]。另一项针对同类型患者的回顾性研究(Fungitell试剂盒)结果提示,cut-off值为ng/L时,G试验的诊断敏感度为87.5%,特异度为89.6%,阳性预测值为70%,阴性预测值为96.3%,其诊断效力与GM试验一致[24]。基于尸检的针对ICU内IA患者的研究(Fungitell试剂盒)结果显示,cut-off为ng/L时,G试验的诊断敏感度为85.7%,特异度为69.7%,阳性预测值为54.5%,阴性预测值为92.0%;但由于G试验的影响因素太多,假阳性率极高,该研究者不建议G试验作为IA的首选或必需筛查手段[25]。对儿童血液病患者IA(Fungitell试剂盒)的诊断,当cut-off值为80ng/L时,G试验的诊断敏感度(56%,90%)和特异度(92%,70.6%)远低于GM试验,阳性预测值仅为26%[26]。因此,诊断IA时G试验的必要性需要进一步研究证实。
对血液系统恶性肿瘤患者IC的诊断,G试验的敏感度和特异度均为80%左右,但阳性预测值较低(10%～60%),阴性预测值多数超过90%,与其他诊断手段如培养、PCR结合时,其诊断敏感度和特异度在90%以上[27-29]。对儿童血液病患者念珠菌血症(Fungitell试剂盒)的研究结果显示,cut-off值为80ng/L时,阳性率为%[30];另一项对新生儿IC的研究结果显示,G试验诊断的敏感度为84%,特异度为75%(Fungitell试剂盒,cut-off值为ng/L)[31]。但ICU内患者G试验的假阳性率太高,严重影响G试验对此类人群的诊断价值[25,32]。
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