耐碳青霉烯肠杆菌目细菌(CRE)的全球传播，限制了常见细菌抗感染治疗的抗菌药物选择范围。碳青霉烯异质性耐药，指在看似等基因的细菌菌群中存在不同水平对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性，碳青霉烯异质性耐药已在世界范围内传播。来自日本的Ryuichiro研究团队，发现了CRE菌株中携带碳青霉烯酶基因质粒的多聚化现象(多聚化是指在宿主细胞DNA重组系统的作用下，质粒与载体之间发生重组会形成二聚体、三聚体，甚至四聚体等质粒寡聚体，稳定性比单体差)以及碳青霉烯酶基因拷贝数的增加，导致菌株对碳青霉烯类药物耐药性的增强。研究结果发表于年6月份mBio杂志上[1]。
研究人员使用Southern印迹、全基因组测序和定量PCR(qPCR)技术对CRE的基因组进行分析，使用blaIMP-6探针(blaIMP-6：编码IMP-6基因的β-内酰胺酶，探针是由仅携带一个blaIMP-6质粒的肺炎克雷伯菌E制备的)，对6株临床分离的CRE菌株(E、E、E、E、E和E)进行Southern印迹，以此对分离株中blaIMP-6基因进行定位，结果显示菌株中blaIMP-6基因位于质粒上(质粒是生物体中染色体以外的具有自主复制能力的闭合环状双链DNA分子)，质粒大小呈等差数列(图1)，最小的质粒约为50kbp，等于等差数列的公差(相邻两个质粒间的差值大致相同)，说明质粒是50kbp质粒的多聚体。进行全基因组测序的E菌株中，仅携带一个全长bp的IncN质粒，命名为pE_IMP6,与pE_IMP6质粒存在99.9%的同源性和93%的覆盖率(图2)。pE_IMP6质粒是全长bp的IncN质粒，在pE_IMP6质粒序列中，pE_IMP6被三组IS91家族的转座酶基因包括起来。研究人员将每个印迹条带中包含的DNA片段序列与E的全基因组序列进行比较，每个条带的质粒由pE_IMP6的DNA序列组成，表明每个条带代表53kbp质粒pE_IMP6的多聚化。使用MinION芯片对E菌株进行全基因组测序证实了质粒多聚体的序列存在。文中将分离株E中的质粒与大肠埃希菌ME及其同源基因recA突变体接合(由一个共同祖先在不同物种中遗传的基因称为同源基因)，接合后的菌株分别命名为ME和JW；E菌株也做同样处理，获得ME与JW菌株。JW菌株中的质粒可进一步接合到携带野生型recA的大肠杆菌菌株TUM中，证明了分离株中条带的可重复性，recA可能通过同源重组介导质粒的多聚化，同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间发生重新组合。
图1Southern印迹梯形带。泳道左侧数字表示碱基长度，结果显示，E菌株携带单个blaIMP-6质粒，其余菌株均携带多个blaIMP-6质粒，大小呈等差数列，公差为48.5kbp；泳道M表示DNA分子量标准。图A为使用blaIMP-6探针在Southern印迹上的梯形带。图B为野生型和接合子的杂交带图谱。图C为pE_IMP6的recA多聚化Southern印迹
图2质粒pE_IMP6和pE_IMP6的比较。箭头表示开放阅读框及其方向，箭头大小与开放阅读框长度成正比，颜色的含义为：红色指碳青霉烯类耐药基因；黄色指其它抗生素耐药基因；浅蓝色指接合转移基因；蓝色指移动元件；灰色指假定的未知基因
定量PCR显示，质粒多聚化导致细菌细胞中blaIMP-6拷贝数和转录增加(拷贝数增加表示在体积相同的菌液中，拷贝数增加的菌液可获得更多的质粒)，从而导致美罗培南耐药性增强。recA的存在可能会增强ME或ME中美罗培南的耐药性。预先暴露于美罗培南环境中，ME细胞中blaIMP-6拷贝数的额外增加进一步增强了菌株ME对美罗培南的耐药性(图3)。过夜暴露于美罗培南中可使ME的细胞生长压力增加，美罗培南MIC由未暴露前的16mg/L上升至32mg/L，recA活性增强并诱导同源重组以及基因组修复，这些过程可能会导致质粒多聚化增加，从而导致blaIMP-6拷贝数增加和美罗培南耐药性增强。
图3过夜暴露于美罗培南后的ME细胞中的blaIMP-6拷贝数增加。图A为大肠埃希菌转化子JW、ME、JW和ME的blaIMP-6拷贝数。纵坐标表示blaIMP-6的拷贝数；使用rrsA作为内部对照基因，通过qPCR确定blaIMP-6的拷贝数。直方柱表示从四次实验中计算的平均值±标准差。WT表示野生型。图B为美罗培南对大肠埃希菌转化子的MIC。纵坐标表示美罗培南的MIC；△recA表示敲除recA后的细菌；点表示三次实验的结果。图C为大肠埃希菌转化子中blaIMP-6的转录水平。纵坐标表示blaIMP-6的转录水平；通过逆转录(RT)-qPCR测量转化细胞中的blaIMP-6转录。直方柱表示blaIMP-6与rrsA的相对mRNA转录率。直方柱表示从五次实验计算的平均值±标准差。图D表示过夜暴露于美罗培南后，ME细胞中的blaIMP-6拷贝数增加。纵坐标表示blaIMP-6的拷贝数；转化细胞中的blaIMP-6拷贝数通过qPCR确定，使用rrsA作为内部对照。直方柱表示从五次重复试验中计算的平均值±标准差。图E表示美罗培南对转化子ME的最低抑菌浓度通过微量肉汤稀释法检测后，结果显示结合recA突变体后的细菌在过夜暴露于美罗培南后MIC增加。纵坐标表示美罗培南的MIC；直方柱表示从非重复实验中计算的平均值±标准差。+与-表示过夜暴露与未暴露美罗培南；使用Mann-WhitneyU检验进行统计分析；*,P＜0.05;ns，意义不显著
总之，携带碳青霉烯酶基因的质粒发生多聚化，并可在大肠埃希菌的宿主细菌细胞中形成各种离散大小的多聚质粒。质粒多聚化以及碳青霉烯酶基因拷贝数的增加导致碳青霉烯酶耐药性增强，而美罗培南的提前暴露很容易加速其耐药性的产生。
参考文献[1]ABER,AKEDAY,SUGAWARAY,etal.EnhancedCarbapenemResistancethroughMultimerizationofPlasmidsCarryingCarbapenemaseGenes[J].mBio,,12(3):e.点评
本文亮点在于质粒多聚化现象的发现。由于质粒携带耐药基因，导致耐药基因拷贝数的增加，最终导致MIC上升，使临床治疗更为棘手。这也为研究细菌耐药性提供一个思路，即采用Southern印迹法观察质粒是否存在多聚，从而导致细菌耐药性增强。
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