细菌对药物的敏感试验
●考点需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验厌氧菌体外药敏试验方法结核分枝杆菌体外药敏试验方法真菌体外药敏试验方法耐药菌株的监测抗菌药物的种类及作用机制1.青霉素类青霉素与青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制细菌细胞壁合成 （1）天然青霉素 种类：青霉素G、青霉素V 作用于不产青霉素酶G+球菌、G-球菌、厌氧菌 （2）耐青霉素酶青霉素 种类：甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林 作用于产青霉素酶的葡萄球菌 （3）广谱青霉素1）氨基组青霉素：氨苄西林、阿莫西林 作用于青霉素敏感的细菌、大部分大肠埃希菌、奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-杆菌2）羧基组青霉素：羧苄西林、替卡西林 作用于产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌和假单胞菌3）脲基组青霉素：美洛西林、阿洛西林、哌拉西林 作用于产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌和假单胞菌2.头孢菌素类 头孢菌素与青霉素结合蛋白结合，发挥抑菌和杀菌效果G+球菌：一代＞二代＞三代G-杆菌：三代＞二代＞一代 第四代头孢菌素作用几乎相同，具有抗假单胞菌的作用 （1）第一代头孢菌素：有头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢吡硫、头孢羟氨苄。 （2）第二代头孢菌素：有头孢孟多、头孢呋辛、头孢尼西、头孢雷特、头孢克洛、头孢丙烯、氯碳头孢。 （3）第三代头孢菌素：有头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟、头孢哌酮、头孢克肟、头孢布烯、头孢地尼、头孢泊肟酯。 （4）第四代头孢菌素：有头孢匹罗、头孢噻利、头孢吡肟和头孢吡普。3.其他β-内酰胺类 单环类 氨曲南和卡芦莫南 对G-作用强，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌 对G+和厌氧菌无作用 拉氧头孢类 抗菌谱广，杀菌作用强，对产β-内酰胺的G-有很强的抗菌作用，对产酶的金黄色葡萄球菌也具有一定的抗菌活性。 头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。 对G+有较好的抗菌活性，对厌氧菌有高度抗菌活性，但对非发酵菌无效。 碳青霉素类 作用特点和机制①具有良好穿透性②与PBP1、PBP2结合，导致细菌细胞的溶解③对质粒和染色体介导的β-内酰胺酶稳定碳青霉素类目前抗菌谱最广的抗菌药物，具有快速杀菌作用。 除了嗜麦芽窄食单胞菌、耐甲氧西林葡萄球菌、尿肠球菌和某些脆弱类杆菌耐药 亚胺培南、美罗培南、比阿培南、帕尼培南、多利培南β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂 与β-内酰胺类抗菌药物联用能增强后者的抗菌活性1）克拉维酸：对产β-内酰胺酶（2a、2b、2c、2d、2e型）的细菌有抑菌活性。2）舒巴坦：常与氨苄西林或头孢哌酮联合应用于肠道感染；对不动杆菌属的作用强。3）他唑巴坦：抑酶作用范围广，几乎包括所有β-内酰胺酶。酶抑制作用优于克拉维酸和舒巴坦。4）复合制剂种类： 加酶抑制剂的复合制剂用于产β-内酰胺酶的革兰阴性和阳性细菌。 包括氨苄西林-舒巴坦、替卡西林-克拉维酸、阿莫西林-克拉维酸、哌拉西林-他唑巴坦及头孢哌酮-舒巴坦。4.氨基糖苷类 作用机制：①依靠离子的附作用，吸附在菌体表面，造成膜的损伤②和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆结合，抑制mRNA的转录和蛋白质的合成，造成遗传密码的错读，产生无意义的蛋白质。 种类：①链霉菌属：如链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②小单胞菌属：如庆大霉素、福提霉素；③半合成氨基苷类：阿米卡星、奈替米星、地贝卡星等，氨基苷类抗菌药物对需氧G-杆菌有较强的抗菌活性，对G+球菌有一定的活性。5.喹诺酮类作用机制：①通过外膜孔蛋白和磷脂渗透进入细菌细胞②作用于DNA旋转酶，干扰细菌DNA复制、修复和重组 （1）第一代：为窄谱抗菌药物，对G+球菌无作用； 主要作用于大肠埃希菌，且迅速出现耐药，较少应用于临床 （2）第二代：对G-和G+细菌均有作用； 比较这类药的抗菌活性强度依次为环丙沙星、氧氟沙星、罗美沙星、氟罗沙星、培氟沙星、诺氟沙星。 （3）第三代：对G+菌作用高于第二代的4～8倍，对厌氧菌亦有作用；司帕沙星、妥舒沙星、左氧氟沙星、加替沙星、格帕沙星、莫西沙星等。6.大环内酯类 作用特点和机制：①可逆结合细菌核糖体50S大亚基的23S单位，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸；②肺部浓度较血清浓度高；③新一代大环内酯类具有免疫调节功能，能增强单核-巨噬细胞吞噬功能。 国内常用有红霉素、吉他霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素。 新一代大环内酯类有克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿奇霉素和乙酰麦迪霉素。对流感嗜血杆菌、军团菌、支原体、衣原体等具有强大的抗菌作用。
第一节 药敏试验中抗菌药物的选用
按临床需要选用抗菌药物的种类；同类抗菌药物仅选一个作为代表；根据测定细菌的种属和感染部位进行选药；参考NCCLS公布的近期有关文件，如《抗菌药物敏感性试验执行标准》，在标准中抗菌药物分为四组，根据相应原则进行选择。
第二节 细菌对药物的敏感试验
概念：指在体外测定药物杀死细菌能力的试验。 药敏试验主要用于：①帮助临床医师选择效果最佳的药物进行感染性疾病的治疗，以避免由于抗菌药物使用不当造成的许多不良后果；②进行流行病学调查；③药敏试验结果还可以用来做某些细菌的鉴定；④指导有关部门制定流行耐药菌的防治措施。一、扩散法（K-B法）目前常用的方法，是一种半定量的方法。美国NCCLS纸片扩散法敏感试验分委会所推荐的标准方法是以Bauer-Kirby建立的K-B法，是目前公认的标准实验方法。 （一）原理： 抑菌圈的大小可以反映待检菌对测定药物的敏感程度，与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。 （二）材料1.培养基：水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH7.2，琼脂厚度为4mm。2.抗菌药物纸片：选择直径6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。3.接种菌液的准备：形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml水解酪蛋白（M-H）肉汤中，35℃培养2～8h。用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准（1.5×／ml的含菌量），校正后的菌液应在15min内接种。 （三）实验步骤以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液均匀涂布接种于M-H琼脂表面置室温干燥3～5min后用无菌镊子或贴纸片机将含药纸片贴于含菌琼脂表面。各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。平板经室温放置15min再倒放于35℃培养箱中培养16～18小时后阅读结果。 （四）结果判读抑圈菌的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。每批试验都应做标准菌株对照，只有对照菌株的敏感度符合标准，实验结果才是可靠的。 试验结果解释分为三级：敏感（S）：表示常规剂量的测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。中介度（I）：不是敏感性的度量，作为“缓冲域”，其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。 耐药（R）：表示常规剂量的测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制检测菌生长。 （五）影响结果的因素1.培养基 培养基的成分、酸碱度、琼脂含量等。2.抗菌药物纸片 纸片含药量是影响抑菌圈大小的主要因素，保存条件以低温干燥为佳。3.菌量 加大菌量可使抑菌圈减小，相反可使抑菌圈扩大。4.操作质量 （1）培养基的厚度。 （2）接种细菌后应在室温放置片刻。 （3）培养温度为35℃为宜。堆放试验平板不超过两个，使其受热均匀。 （4）测量抑菌量应仔细、精确，从生长刺激带测量。 （六）质量控制1.质控菌株 采用标准菌株是进行质控的主要措施。金黄色葡萄球菌ATCC，大肠埃希菌ATCC，铜绿假单胞菌ATCC，粪肠球菌ATCC或ATCC。2.抑菌圈质控范围 每种抗菌药物对四个质控菌株的抑菌圈，允许范围，为95%的可信限，即实验室日间质控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中，仅允许有一个超出这个范围。二、稀释法体外定量测定抗菌药物抑制待测菌生长活性的方法根据稀释培养基的不同，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。琼脂稀释法是细菌药敏试验的金标准。稀释法所测得的某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度为最低（或最小）抑菌浓度（MIC），稀释法也可测定最小杀菌浓度（MBC）。 （一）肉汤稀释法1.原理 以水解酪蛋白（M-H）液体培养基将抗菌药作不同浓度的稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制该菌的最低浓度（MIC）或杀死该菌的最低（或最小）杀菌浓度（MBC）。2.材料（1）抗菌药物原液的配制：溶剂一般为蒸馏水、磷酸盐缓冲液或乙醇等，稀释剂多为蒸馏水。原液以过滤法除菌，小量分装使用。大部分抗菌药物原液在-20℃以下可保存三个月，而在4℃以下只能保存一周。（2）培养基：一般细菌采用M-H液体培养基。（3）接种菌液的制备： 在已分纯的待测菌平板上挑取4～5个形态相同的菌落接种于3～5mlM-H液体培养基内，35℃培养4～6h；校正菌液浓度，使其相当于0.5麦氏比浊标准，再用M-H液体培养基按1：稀释后备用。稀释后的菌液应在15min内接种。3.试验步骤 （1）试管10～15支。 （2）各管倍比稀释抗菌药物，含量依次为、…0.03μg／ml。另设培养液对照，检测菌生长对照和质控菌生长对照管各一支，每管1ml。 （3）将已校正浓度的待测菌悬液依次加入含药管内，每管0.05ml，混匀。各试管置35℃培养16～18小时后观察结果。 结果判读：凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌最低抑菌浓度（MIC）。再以0.01ml容量接种环取肉眼观察认为无菌生长的试管移种一环于血琼脂平板作次代培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9%原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度（MBC）。 影响结果的因素 （1）培养基：培养基的pH、渗透压及电解质。 （2）抗菌药物：抗菌药物必须采用标准粉剂。配好的药物原液应在有效期内使用。 （3）结果观察时间：应在12～18h之间观察。 质量控制：金黄色葡萄球菌ATCC、大肠埃希菌ATCC、粪肠球菌ATCC、铜绿假单胞菌ATCC。超过或低于预期值范围一个稀释度以上，不应向临床发出报告，应检查出现差错的原因以及标准菌株被污染和变异的可能性。 （二）琼脂稀释法 将待测菌接种于含不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度。 （三）E-test稀释法与扩散法相结合的一种方法，直接定量试验。把含有干燥的稳定的药物塑料条贴在琼脂平板的表面，经培养在一定范围抑制细菌生成，形成抑菌环。三、杀菌试验1.最低杀菌浓度 最低杀菌浓度是某抗菌药物能杀灭99.9%以上的测试菌量的最低药物浓度。测定方法就是稀释法MIC测定的基础上通过再转种、再孵育，最终测得某种抗菌药物对被测菌的MBC。2.时间-杀菌曲线 主要用于评价一种抗菌药物对测试菌的杀菌速率，以及两种或两种以上抗菌药物对测试菌的联合杀菌活性。操作时培养基和测试菌的准备等与测定MIC的肉汤稀释法相同，设定不同培养时间进行细菌计数。最后将各时间点测得的平均菌落计数在半对数坐标纸上绘制杀菌曲线。四、体外联合药物敏感试验 （一）联合抑菌试验1.试管棋盘（方阵）稀释法根据A药和B药的MIC确定药物联合测定的稀释度。一般选择6～8个稀释度左右，每种药的最高浓度为其MIC的2倍。根据测定结果按下列公式计算部分抑菌浓度指数（FIC）：FIC＝A药联合时的MIC／A药单测的MlC+B药联合时的MIC／B药单测的MIC判断标准：FIC指数＜0.5协同作用；FIC指数0.5～1相加作用FIC指数1～2无关作用；FIC指数＞2拮抗作用2.微量棋盘（方阵）稀释法 基本方法与MIC测定的肉汤稀释法相同，按“棋盘”稀释法原则组合。3.琼脂棋盘（方阵）稀释法 基本方法与MIC测定的琼脂稀释法相同，以含有不同组合浓度的MH琼脂平板代替以上含有不同组合浓度药物的MH肉汤试管。按“棋盘”稀释法原则组合。 （二）联合杀菌试验联合杀菌试验所用的方法同前述的时间-杀菌曲线法。分别测定并绘出两种药物对被测菌的单独杀菌曲线和联合后的杀菌曲线，根据杀菌曲线判断联合用药的结果。五、厌氧菌、结核分枝杆菌及酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验 （一）厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验 除培养基、操作环境和培养条件等根据厌氧菌的特定需要变动外，基本原理和方法与需氧菌稀释法药敏试验相同。 （二）结核分枝杆菌的体外抗菌药物敏感试验主要有比例法、绝对浓度法和耐药率法。直接法是直接采用涂片阳性的标本直接药敏试验，优点是可提前2～3周获得结果，缺点是易污染杂菌并且接种菌量亦不好控制。间接法是采用纯培养进行药敏试验。目前最常使用的方法是间接比例法。 用制备好菌悬液同时接种含有抗菌药物的培养基和不含抗菌药物的生长对照培养基，如果含有抗菌药物培养基上的细菌生长量超出生长对照培养基上生长量的1%时即判断为耐药。 （三）酵母样真菌的体外抗菌药物敏感试验1.常量肉汤稀释法 （1）药物稀释：将待测的抗菌药物用培养基进行一系列稀释，分别加入试管内，每管0.1ml。 （2）接种菌悬液准备：挑取5个直径≥1mm的菌落混悬于5ml生理盐水中，校正至0.5麦氏浊度。接种前用生理盐水再稀释1：，最后用培养基再稀释10倍。最终接种菌量为1×～5×CFU／ml。 （3）接种、孵育：将0.9ml的菌悬液接种至各试管中，同时设生长对照和阴性对照管，混匀后置35℃孵育48小时。 （4）结果判断：肉眼观察各管的生长情况。二性霉素B的MIC为抑制测试菌肉眼可见生长的最低药物浓度5-氟胞嘧啶和吡咯类常采用80%MIC判断标准，即抑制80%检测菌生长的最低药物浓度为其MIC。 （5）质量控制：标准菌株在与测试菌相同条件下进行药敏试验六、体内抗菌药物的浓度与活性测定 （一）体内抗菌药物的浓度测定1.微生物测定法——琼脂扩散法分为比浊法、试管稀释法和琼脂扩散法等三类方法。琼脂扩散法又分多种，其中纸片法简单易行。针对某一种抗生素应选择对其敏感而尽量对其他药物耐药的指示菌；利用直径6.3mm，吸水量为20ml的滤纸片和该抗菌药的标准液制成标准药敏纸片。方法同药敏试验，每种抗生素至少同时测定4种浓度，每种浓度至少平行进行2组，35℃孵育16～20小时，测量抑菌圈直径以直径的平均值为横坐标，标准液浓度为纵坐标，在半对数纸上绘制标准曲线。被测标本按同样程序操作，得到抑菌圈直径后，可在标准曲线上读出相应的抗菌药物含量。2.非微生物测定法 （1）荧光偏振免疫测定法。 （2）高压液相色谱法。 （3）均相免疫测定法。 （4）放射免疫测定法。 （二）体内抗菌药物的活性测定临床微生物学实验室测定体液内抗菌药物活性的方法，有血清抑菌力和杀菌力测定，其原理与肉汤稀释法测MIC以及MBC的原理类同。一般认为血清抑菌力／杀菌力高于1:8或1:16时，认为治疗方案有效，如为严重感染，血清抑菌力／杀菌力应高于1:64。
第三节 细菌的耐药性和产生机制
常见抗生素及作用机制：
作用机制
抗生素
阻断细菌细胞壁肽聚糖的合成
青霉素类、头孢菌素、单环β-内酰胺类、碳青酶烯类、糖肽类
结合细菌核糖体50S大亚基，抑制蛋白合成
大环内酯类、林可酰胺类、氯霉素类
结合细菌核糖体30S小亚基，抑制蛋白合成
氨基糖甙类、四环素类
作用于DNA螺旋酶，抑制DNA合成
喹诺酮类
干扰细菌氧化还原系统，阻断代谢
硝基呋喃类
竞争结合二氢叶酸合成酶
磺胺类
一、细菌耐药的机制1.产β-内酰胺酶 是细菌对β-内酰胺类药物耐药的主要机制。2.产生钝化酶 如氨基糖苷类钝化酶、氯霉素乙酰转移酶等。3.青霉素结合蛋白的改变 如MRSA的耐药机制。4.药敏作用靶位的改变5.抗菌药物渗透障碍 （1）外膜蛋白减少 （2）药物外排作用二、细菌耐药性表型的检测1.超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） （1）超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）常见于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌。ESBLs可以水解青霉素一、二、三代头孢菌素和氨曲南，但头霉菌素和碳青酶烯类不受影响。 （2）K-B法筛查可选用头孢吡肟≤17mm、头孢他啶≤22mm、头孢噻肟≤27mm、氨曲南≤27mm、头孢曲松≤25mm。确认试验：K-B法贴两组纸片一头孢他啶、头孢他啶／棒酸；头孢噻肟、头孢噻肟／棒酸，若两组中任何一组加棒酸的抑菌环直径与相应不加棒酸的抑菌环直径相差≥5mm，则判断此菌为产ESBLs菌株。稀释法若两组中任何一组加棒酸的MIC值比相应不加棒酸的MIC值降低3个以上稀释倍数，则判断此菌为产ESBLs菌株。 （3）产ESBLs的克雷伯菌属及大肠埃希菌分离株，临床上可能对青霉素类、头孢菌素类及氨曲南治疗无效，即便体外有时敏感。对所有产ESBLs的菌株应当报告为耐所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南。2.葡萄球菌属 （1）MRS对耐甲氧西林的耐药是由于本身存在的MecA基因编码的异常PBPs所致。MRS除对甲氧西林耐药外，还常常对其他类抗生素耐药，呈现多重耐药性。 （2）用头孢西丁纸片法或稀释法检测MRS。头孢西丁MIC≥μg／ml应报告苯唑西林耐药。 （3）MRS对头孢菌素和复合性β内酰胺类如阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林／舒巴坦、替卡西林／克拉维酸、哌拉西林／三唑巴坦和亚胺培南可在体外显示活性但临床无效，因此不应报告敏感。3.肠球菌属 （1）对氨基糖苷类呈耐药性的肠球菌（HLAR）的测定用高浓度庆大霉素或链霉素进行高水平耐药筛选，可预测氨苄西林、青霉素或万古霉素和一种氨基糖苷类的协同效应。 （2）纸片扩散法庆大霉素（μg）、链霉素（μg）判断生长出菌落为HLAR。 （3）对于肠球菌属，头孢菌素、氨基糖苷类（筛选高水平耐药除外）、克林霉素和磺胺类可在体外显示活性，但临床无效，不应报告敏感。 （4）耐万古霉素的肠球菌（VRE）获得性耐药分两种表型，VanA和VanB，天然耐药为VanC型。 判断：菌落生长为耐药。4.肺炎链球菌 （1）肺炎链球菌对青霉素的耐药是由于PBP的改变，减低了对β-内酰胺类的亲和力。 （2）肺炎链球菌对青霉素的耐药性检查（PRP）采用1μg苯唑西林的纸片筛选法。苯唑西林的抑菌圈≤19mm的菌株应当测定青霉素和头孢噻肟或头孢曲松的MICs。5.产AmpC酶的革兰阴性杆菌 （1）AmpC酶属于BushⅠ型酶主要由肠杆菌属、弗劳地枸橼酸盐杆菌、摩根菌、黏质沙雷菌、铜绿假单胞菌产生，由染色体介导，又称染色体Ⅰ型酶。 （2）对青霉素、注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠、三代头孢及氨曲南耐药，对亚胺培南及四代头孢菌素敏感。亚胺培南同时又是强诱导剂，如果产酶的主持基因发生去阻遏改变，会出现持续高产酶株。临床上一旦发现产AmpC酶菌株感染，应严格控制使用除四代头孢菌素以外的β-内酰胺类。 进行药物敏感性研究应选择细菌生长的哪一期A.迟缓期B.对数生长期C.稳定期D.衰亡期E.均可
[答疑编号502383201]
B
MBC是指A.最低抑菌浓度B.最低杀菌浓度C.敏感D.最大抑菌浓度E.最大杀菌浓度
[答疑编号502383202]
B
肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌产生ESBLsA.所有抗菌药物根据药敏试验结果选用B.头孢菌素类抗生素根据药敏试验选用C.除检测ESBLs的靶抗菌药物外，其他药物根据药敏结果选用D.氨曲南无论体外药效结果如何，临床治疗均无效E.以上全部错误
[答疑编号502383203]
D
K-B法中细菌的接种量对抑菌圈大小的影响叙述正确的是A.增加接种量可使抑菌圈扩大B.增加接种量可使抑菌圈缩小C.减少接种量可使抑菌圈扩大D.减少接种量可使抑菌圈缩小E.接种量的改变对抑菌圈的大小无影响
[答疑编号502383204]
BC
关于体外药敏试验的稀释法，以下叙述正确的是A.稀释法所稀释的是某抗菌药物B.稀释法测定的是某抗菌药物对细菌的MBC值C.稀释法测定的是某抗菌药物对细菌的MIC值D.MIC即能抑制细菌肉眼可见生长的最小药物浓度E.稀释法包括肉汤稀释法和琼脂稀释法
[答疑编号502383205]
ACDE
NCCLS推荐的检测的ESBLs双纸片法确认试验中选用两组药物为A.头孢他啶，头孢他啶+棒酸；头孢噻肟，头孢噻肟+棒酸B.氨曲南，氨曲南+舒巴坦；头孢噻肟，头孢噻肟+棒酸C.头孢他啶，头孢他啶+棒酸；头孢曲松，头孢曲松+他唑巴坦D.氨苄西林，氨苄西林+舒巴坦；哌拉西林，哌拉西林+他唑巴坦E.氨曲南，氨曲南+舒巴坦；头孢曲松，头孢曲松+他唑巴坦
[答疑编号502383206]
A
检验之韵欢迎您
赞赏
